MIK AZOK A MIKROMŰANYAGOK?
Mikroműanyagként definiáljuk azokat a szintetikus polimereket, melyek legnagyobb kiterjedése 5 mm-nél kisebb. Elsődleges mikroműanyagoknak nevezzük azokat a műanyagokat, amelyek mérete gyártásukból adódóan nem haladja meg az 5 mm-t.
Ezek többnyire gyógyszerekben és szépségápolási termékekben, például arc- és testradírokban kerülnek felhasználásra, majd a háztartásokból kijutva a szennyvíztisztító telepeken át a tisztított szennyvízzel együtt a természetes vizekbe kerülhetnek.
Másodlagos mikroműanyagok a nagyobb műanyag tárgyak, használati cikkek, textíliák kopása vagy fizikai aprózódása során jelennek meg (Parrag 2021). Magyarországon először Bordós és munkatársai azonosítottak felszíni vízi környezetben mikroműanyagszennyezést, eredményeik alapján a vizsgált felszíni víz minták 92%-ában, illetve az üledékminták 69%-ában volt mutatható ki mikroplasztik. Víz esetében a polipropilén (PP) és polietilén volt a leggyakoribb műanyagtípus, míg üledékmintákban a PP és a polisztirol bizonyult dominánsnak (Bordós et al. 2019). Az eltelt évek során több hazai és nemzetközi kutatás vizsgálta a felszíni vizek és az elfolyó tisztított szennyvíz mikroműanyagkoncentrációját, melyek eredményeként azt a következtetést vonták le, hogy a szennyvíztisztítók jelentős mikroműanyageltávolítási hatásfokkal rendelkeznek (84–99%), ám a nyers szennyvíz magas kiindulási mikroműanyag-koncentrációja miatt mégis a vízi környezetbe kerülő mikroműanyagok lehetséges forrásainak tekintendők (Rolsky et al. 2020). Emellett a szennyvíztisztítási eljárás során keletkező szennyvíziszap is tartalmaz mikroműanyagot, mely a talajba jutva szintén közvetítője lehet a mikroműanyag-szennyezésnek (Reddy & Nair 2022).
Napjainkig a legtöbb kutatás elsősorban a mikroműanyagok környezetben való megjelenésével, azok jellemzésével (anyagi tulajdonság, méret) foglalkozott, azonban kevesebb figyelmet kapott a műanyagrészecskék felületén adszorbeálódó vegyszerek és gyógyszermaradványok (Fred-Ahmadu et al. 2020), valamint a felületükön megtapadó biofilmképző mikroorganizmusok jelentette problémakör (Zhang és Chen 2020).
ANTIBIOTIKUM-REZISZTENCIA
Napjainkban a fertőző megbetegedések kezelésének hatásos módszere az antimikrobiális szerek, antibiotikumok alkalmazása, melyek specifikus gátló hatást fejtenek ki a mikroszervezetekre, ugyanakkor az emberi szervezetben nem vagy alig okoznak toxicitást. Az antibiotikumok használata ugyanakkor nagy körültekintést igényel, mivel rendszeres, ismétlődő vagy felesleges alkalmazásuk a célszervezetek (elsősorban baktériumok) körében rezisztenciához, azaz ellenálló képesség kialakulásához vezethet (Wright 2010). Lakossági, mezőgazdasági és ipari forrásokból gyakran kerülnek a környezetbe gyógyszermaradványok, ezen belül pedig antibiotikumok, melyeknek egy része metabolikus átalakulás nélkül, eredeti formájában jut a környezetbe, így nem szűnik meg biológiai aktivitása (Kotchen et al. 2009). Az antibiotikum-maradékanyagok egyedszinten hatással lehetnek a vízben élő szervezetekre, rendszerszinten pedig a táplálékláncokra és akár a parti szűrésű kutakból nyert ivóvízből is kimutathatók (Heberer 2002).
Az antibiotikum-rezisztencia nem ismeretlen a környezetben: egy mikroorganizmus természetes jellegéből adódóan, szervezeti felépítése és funkcionális tulajdonságai révén is rendelkezhet ellenálló képességgel. Környezet-egészségügyi szempontból ugyanakkor nem a természetes, hanem a szerzett antibiotikum-rezisztenciának van kiemelt jelentősége: ebben az esetben a baktériumok képesek horizontális géntranszfer útján, ún. mobilis genetikai elemeken kódolt rezisztenciagéneket átadni egymásnak (Losonczy 2001). A folyamat eredménye olyan többszörösen rezisztens (multirezisztens, pánrezisztens) baktériumok kialakulása, melyek esetében az eddig hatásosnak bizonyuló antimikrobiális szerek többsége vagy akár mindegyike hatástalanná válhat (Magiorakos et al. 2012). A legfontosabb antibiotikumrezisztencia-mechanizmusokat foglalja össze az 1. ábra.
Az antibiotikumokkal szemben ellenálló baktériumok világszerte jelentős közegészségügyi kockázatot jelentenek, melyet a Világegészségügyi Szervezet (World Health Organization) is az egyik legsúlyosabb globális egészségügyi problémának tekint. Az egyik legjelentősebb, humán egészségügyi kockázatot jelentő mikroszervezet a Gram-negatív Pseudomonas aeruginosa baktériumfaj (Losonczy 2001), mely képes többszörös antibiotikum-rezisztencia (multirezisztencia) kialakítására (Garnacho-Montero és Amaya-Villar 2022), biofilmképzésre (Colvin et al. 2011), emellett kimutatható szennyvízben is (Dumontet et al. 2001).
MIKROMŰANYAGOK ÉS AZ ANTIBIOTIKUM-REZISZTENCIA
Az antibiotikum-rezisztens baktériumok gyakran képesek biotikus vagy abiotikus felületen biofilmet képezni, melyet poliszacharidok extracelluláris termelésével alakítanak ki. Strukturált biofilmbe ágyazva a mikroorganizmusok tartósan képesek egymáshoz és különböző felületekhez kötődni, valamint ellenállóbbá válnak a környezeti hatásokkal (fertőtlenítőszerekkel, antibiotikumokkal) szemben (Radó 2019).
A biofilmet kialakító mikroszervezetek képesek kis molekulájú kémiai jelanyagokkal kommunikálni, illetve egymásnak rezisztenciagéneket átadni, melynek következtében a biofilmben élő mikrobaközösség antibiotikumokkal szembeni ellenálló képessége akár százszorosa is lehet a lebegő sejtekhez képest (Bowler et al. 2020). A biofilm viszkózus anyagában lelassul a sejtek anyagtranszportja, így az antibiotikumoknak alig van esélye a sejtek közelébe jutni, sőt megkötődhetnek a sejteket körülölelő anyagban, ahol lebontásra kerülhetnek különböző enzimek által. A biofilm kialakítása tehát a környezeti antibiotikumrezisztencia egyik gócpontjának tekinthető. A környezetbe kerülő műanyaghulladék és a mikroműanyagok ideális abiotikus felületet jelentenek a mikrobiális biofilmek kialakulásához, így a környezeti antibiotikum-rezisztencia kialakulásában és terjedésében feltehetően a mikroműanyagok is szerepet játszanak (He et al. 2022).
CÉLKITŰZÉSEK
A mikroműanyagok, gyógyszermaradványok, antibiotikumok és antibiotikumrezisztencia-gének egyidejűleg jelen lehetnek a felszíni víztestekben, így hatással lehetnek a természetes vízi ökoszisztémára. Ezért kutatásunk során célul tűztük ki egy kiválasztott magyarországi felszíni víztest esetében az antibiotikumrezisztens és biofilmképzésre képes mikroszervezetek gyakoriságának felmérését 3 mintavételi helyszínen. Munkánk során különös figyelmet fordítottunk a közegészségügyi jelentőséggel bíró baktériumok közül a kiemelt kockázatot jelentő P. aeruginosa faj képviselőinek izolálására: a kimutatott törzseket antibiotikum-rezisztencia és műanyag felületen történő biofilmképzés szempontjából részletesen jellemeztük.
VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ÉS EREDMÉNYEIK
A mikrobiológiai vizsgálatok a Magyar Agrár- és Élettudományi Egyetem (MATE) Akvakultúra és Környezetbiztonsági Intézetének mikroműanyag-kutatásaihoz kapcsolódóan folytak. A felszíni víztestek mintavételezése és vizsgálata 2022. május–július között, a Zagyva mint intenzív antropogén terhelés alatt álló felszíni víz mentén történt három mintavételi helyszínen a felszíni vizek mintavételezésére vonatkozó magyar szabványoknak megfelelően (MSZ 12750-2:1971. Felszíni vizek vizsgálata, MSZ EN ISO 5667-1:2007 Mintavétel felszíni vizekből). A vízmintákat steril mintatartó edényekbe vettük, majd hűtve laboratóriumba szállítottuk, és 24 órán belül megkezdtük azok feldolgozását. A mikrobiológiai vizsgálatok folyamatát foglalja össze a 2. ábra.
A vizsgálatok során szelektív és differenciáló táptalajok segítségével elkülönítettük a colistin (COL) és carbapenem (CRE) típusú antibiotikumokkal szemben rezisztens, tenyészthető baktériumokat, illetve a P. aeruginosa faj képviselőit, valamint meghatároztuk a mintákra jellemző telepszámokat. Ezt követően a típusos telepek kioltásával tisztatenyészeteket hoztunk létre, majd molekuláris biológiai módszerrel (16S rDNS szekvenálás) fajszinten azonosítottuk az izolált baktériumtörzseket.
A mikrobiológiai vizsgálatokat kiegészítve a vízminták fizikokémiai paramétereinek helyszíni mérését is elvégeztük, a gyógyszermaradványok és ezen belül az antibiotikumok kimutatására irányuló kémiai analitikai vizsgálatokat pedig az Eurofins Analytical Services Hungary Kft. hajtotta végre. A helyszíni mérések során a fizikokémiai paraméterekre vonatkozóan (pH, vezetőképesség, vízhőmérséklet, oldott oxigénszint, redoxpotenciál) nem tapasztaltunk kiugró értékeket. A kémiai analitikai vizsgálatok eredményei alapján elmondható, hogy mindhárom vizsgálati helyszínen kimutattunk gyógyszermaradványokat, az összegzett gyógyszermaradvány-koncentráció 0,29–15,3 μg/L között mozgott. A vizsgált gyógyszermaradványoknak átlagosan 12–27%-a volt antibiotikum. Legnagyobb mennyiségben a fluorokinolonok hatóanyagcsoportjába tartozó ciprofloxacin és ofloxacin, illetve a szulfonamid típusú antimikrobiális szerek, mint a szulfamerazin és szulfametoxazol volt kimutatható.
A gyógyszermaradványok kimutatásával párhuzamosan minden mintavételi pont esetében meghatároztuk a COL/ CRE-rezisztens mikroszervezetek telepszámát. A vizsgálat során COL és CRE tartalmú szelektív és differenciáló Chromatic™ táptalajra (Liofilchem®) szélesztettünk a hígítatlan vízmintákból 100 μL-t. Ezt inkubáció követte 96 órán keresztül 35 °C-on, melynek végén a Chromatic táptalajnak köszönhetően az egyes baktériumnemzetségeket telepmorfológia és telepszín alapján nagy biztonsággal el lehetett különíteni, illetve a vizsgálati módszer a telepszám (CFU, colony forming units) meghatározását is lehetővé tette (lásd 3. ábra). Eredményeink alapján az antibiotikum-koncentráció a vizsgált három helyszín közül egy esetében (I. helyszín) mutatott egyértelmű összefüggést az antibiotikumrezisztens mikroorganizmusok telepszámának növekedésével, így feltételezhetjük, hogy az antibiotikum-terhelés jelentős, ám nem kizárólagos oka az antibiotikum-rezisztens mikroszervezetek környezeti térnyerésének.
A tisztatenyészetek létrehozását követően 112 COL/CRE-rezisztens baktériumtörzset azonosítottunk fajszinten. Megállapítottuk, hogy a colistinrezisztens mikroorganizmusok között a természetes rezisztenciával rendelkező Serratia és Proteus fajok mellett kimutatható volt a Dickeya zeae faj, valamint az Aeromonas rivipollensis, noha az Aeromonas nemzetség képviselői a szakirodalom alapján jellemzően érzékenyek a colistinre (Aghapour et al. 2022). A leggyakrabban kimutatható CRE-rezisztens baktériumok közé a Pseudomonas és az Aeromonas nemzetség tagjai tartoztak, melyek feltételezhetően szerzett antibiotikum-rezisztenciával rendelkeznek. A három helyszínen összesen 11 P. aeruginosa törzs került azonosításra, melyeket fajszintű azonosításukat követően további részletes vizsgálatnak vetettük alá: meghatároztuk a kimutatott törzsek antibiotikumrezisztenciaprofilját 10 hatóanyagra nézve minimális gátló koncentrációérték (MIC) meghatározást lehetővé tevő fenotípusos módszerrel, illetve biofilmképző képességüket polisztirol (PS) műanyag felületén.
A rezisztenciavizsgálatok során Mueller–Hinton-táptalajra szélesztett baktériumgyepre helyeztük az antibiotikummal átitatott tesztcsíkokat, majd 35 °C-on, 24 órás inkubáció után leolvastuk és az EUCAST ajánlásai alapján értékeltük a számszerű MIC-értékeket (lásd 4. ábra). Eredményeink alapján a P. aeruginosa faj képviselői között megfigyelhető a klinikai szempontból kiemelt jelentőséggel bíró carbapenemek csoportjába tartozó doripenem és imipenem, továbbá a cefalosporinokhoz sorolandó cefepime hatóanyagokkal szembeni rezisztencia. A vizsgált törzsek közül egy multirezisztens törzset azonosítottunk, mely háromféle, két különböző hatóanyagcsoportba tartozó antibiotikummal szemben mutatott egyidejűleg ellenálló képességet.
A vizsgálatba vont P. aeruginosa baktériumtörzsek biofilmképző képességét a Stepanovic és munkatársai által publikált, módosított mikrotiter plate módszer alapján vizsgáltuk meg (Stepanovic et al. 2000) polisztirol felületén. A PS anyagú üregekbe baktériumszuszpenziót és tápoldatot mértünk be, majd 96 órán át 35 °C-on statikus beállítás mellett inkubáltuk. Az üregek foszfátsóoldatos átmosása után metanollal fixáltuk a baktériumsejteket, majd kristályibolya-oldattal megfestettük azokat. Ezt követően a kitapadt, megfestett sejteket jégecet segítségével visszaoldottuk, végül megmértük az oldat optikai denzitását (abszorbanciáját).
A negatív kontrollhoz viszonyított érték alapján négyfokozatú skálán (nincs, gyenge, közepes, erős) értékeltük a biofilmképzés intenzitását, melynek alapján megállapítottuk, hogy mindegyik vizsgálatba vont P. aeruginosa törzs legalább gyenge vagy mérsékelt biofilmképződést mutatott PS felületen, azaz képesek lehetnek a polisztirol anyagú mikroműanyagok felületét kolonizálni.
ÖSSZEFOGLALÁS
Eredményeink alapján a Zagyva mentén lokálisan jelentős lehet a különböző forrásokból származó antibiotikum-terhelés, mely egyes esetekben összefüggésben állt a colistin- és carbapenemrezisztens mikroszervezetek számának emelkedésével. A kiemelt környezetbiztonsági jelentőségű P. aeruginosa faj kimutatott törzsei 10 antibiotikum-hatóanyaggal szemben mutatott ellenálló képességük alapján jellemzően antibiotikum-érzékenyek voltak, azonban egyes klinikai szempontból jelentős hatóanyagok (például a carbapenemek) hatékonyságának csökkenése vagy elvesztése, bizonyos esetekben pedig multirezisztencia is megfigyelhető volt körükben. A biofilmképző képesség vizsgálati eredményei alapján megállapítható, hogy az azonosított P. aeruginosa törzsek mindegyike képes biofilmet képezni polisztirol felületen, mely alapján feltételezhető, hogy szerepük lehet a mikroműanyagok kolonizációjában. Mivel a természetes vizekben jelen lévő mikroműanyagok a gyógyszermaradványok és patogén mikroszervezetek vektorának tekinthetők, célszerű lenne olyan intézkedéseket bevezetni, melyek megelőzik kijutásukat a környezetbe. A szennyvíztisztítók esetében javasolható olyan fejlettebb technológia alkalmazása, mint a vízszűrő filterek, ózonizáció és az oldott levegős flotáló (DAF), melyekkel egyes vizsgálatok szerint a mikroműanyagok közel 100%-a eltávolítható (Iyare et al. 2020). A felszíni víztestek állapotának megóvása érdekében indokolt azok fizikai, kémiai, biológiai paramétereinek rendszeres monitorozása, mely alapján a jövőben kidolgozásra kerülhet a még nem nevesített szennyező anyagokra egy észszerű, jogszabályok által meghatározott határérték.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
A kutatómunka az Innovációs és Technológiai Minisztérium Nemzeti Kutatási Fejlesztési és Innovációs Alapból nyújtott támogatásával, a Piacvezérelt Kutatás-fejlesztési és Innovációs Projektek támogatása pályázati program finanszírozásában (2020-1.1.2-PIACI-KFI-2021-00239), valamint az Innovációs és Technológiai Minisztérium által kiírt Tématerületi Kiválósági Program (TKP2021), Nemzetvédelem és Nemzetbiztonság alprogram pályázat (TKP2021-NVA-22) támogatásával valósult meg. Dzsudzsák Emília Laura munkáját az Innovációs és Technológiai Minisztérium Új Nemzeti Kiválósági Programja (ÚNKP23-2-I-MATE-16), dr. Kaszab Edit témavezetői munkáját a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (BO/00236/20/4) támogatta.
IRODALOM
Allen H. K., Donato J., Wang H.H., Cloud-Hansen K.A., Davies J., Handelsman J. (2010): Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.
Nature Reviews Microbiology, 8: 251–259.
Aghapour Z., Gholizadeh P., Ganbarov K., Bialvaei A. Z., Mahmood S. S., Tanomand A., Yousefi M., Asgharzadeh M., Yousefi B., Kafil H. S. (2019): Molecular mechanisms related to colistin resistance in Enterobacteriaceae, Infection and Drug Resistance, 12: 965-975.
Bordós G., Urbányi B., Micsinai A., Kriszt B., Palotai Z., Szabó I., Hantosi Zs., Szoboszlay S. (2019): Identification of microplastics in fish ponds and natural freshwater environments of the Carpathian basin, Europe. Chemosphere, 216: 110–116.
Bowler, P., Murphy, C. & Wolcott, R. (2020): Biofilm exacerbates antibiotic resistance: Is this a current oversight in antimicrobial stewardship? Antimicrob Resist Infect Control, 9: 162.
Colvin, K.M., Irie, Y., Tart, C.S., Urbano, R., Whitney, J.C., Ryder, C., Hwell, P.L., Wozniak, D.J., Parsek, M.R (2011): The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix.
Environmental Microbiology, 14(8): 1913–1928.
Dumontet S., Scopa A., Kerje S. & Krovacek K. (2001): The Importance of Pathogenic Organisms in Sewage and Sewage Sludge, Journal of the Air & Waste Management Association, 51(6): 848-860.
Forrás: Vízmű Panoráma