A viszonylag egyszerűbben kivitelezhető eljárások, mint pl . a vesszők melegvizes kezelése nincsen hatással a vírus és viroid fertőzésekre, így a mentesítés során drágább és összetettebb módszereket kell alkalmaznunk ahhoz, hogy ezektől a jelentős gazdasági károkat okozó kórokozóktól megszabadulhassunk . Korábban, a hetvenes évektől, a mai MATE Szőlészeti és Borászati Intézetének egyik jogelőd intézményében (a Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Kecskeméti Kutatóállomásán) az egészséges szőlő szaporítóanyagot biológiai indexelés alapján szelektálták ki, azonban ma már az új klónok esetében nagyon kicsi az esélye, hogy az egységes származású és szaporítású nemesítői állományok teljesen egészséges egyedeket tartalmazzanak . Ezért a Kutatóállomáson hajtáscsúcs- és merisztéma kultúrákat alkalmaztak a prebázis állományok alapjául szolgáló kiindulási állományok létrehozására . A merisztéma kultúrák kialakítása során a hajtáscsúcs 0,2-0,5 mm-es merisztéma kupoláját preparáljuk ki sztereomikroszkóp alatt, a kis méret segíti a vírusmentes szövetrészek izolálását . Az elmúlt évek merisztémára alkalmazott intenzív mentesítési munkája ugyanakkor bebizonyította, hogy ezzel a módszerrel nem tudunk minden növényi vonalat mentesíteni, mivel a módszer sikere függ a genotípustól is . Ezekben az esetekben a merisztématenyésztés mellett két lehetséges módszert: a kemoterápiát és a szomatikus embriogenezist kezdtük alkalmazni . Míg a kemoterápia olyan vegyületek alkalmazását jelenti, amelyek gátolják a vírus sokszorozódását a növényben, a szomatikus embriogenezis egyetlen sejtből is képes hatékonyan egészséges növényt létrehozni, így a két módszer eltérő módon képes áthidalni a merisztématenyésztés nehézségeit . Mivel az egészséges kiindulási állományok megalapozzák a sikeres termesztést, kötelességünk az ezt megalapozó technológiai háttér folyamatos fejlesztése .

Szomatikus embriogenezis

Szomatikus embriogenezisről akkor beszélünk, amikor egy növény testi sejtjeiből (pl. a levél egy sejtjéből) embriót hozunk létre . Ebben az esetben az embrió genetikailag (ha nem történik mutáció) megfelel az anyanövény genotípusának, tehát fajtaazonos . Az embrió jó esetben csírázik és gyökeresedik, így belátható időn belül egy teljes növényhez juthatunk (1. A-D kép) .

Ezeknek az embrióknak a fejlődése jellemzően egy (vagy legfeljebb néhány) sejtből indul el, így ezzel a szaporítási móddal megszabadulhatunk a legtöbb kórokozótól . Mivel az embrió nem áll kapcsolatban az anyanövényben található szállítónyalábokkal, így a baktériumok és gombák átvitele gátolt . Sőt az eddigi eredmények alapján alkalmas arra, hogy használatával megszabaduljunk a vírusoktól, viroidoktól és fitoplazmáktól is .

A szomatikus embriogenezist a növények széles körén alkalmazták már vírusmentesítésre, így avokádón, citrusféléken, cukornádon, fekete borson, kakaón, maniókán és szőlőn is . A saját eredményeink (Turcsán és mtsai, 2020) és a nemzetközi publikációk alapján eddig 21 különböző vírus eliminálására volt alkalmas ez a módszer, ezek között találhatóak egy- és kétszálú DNS vírusok, egyszálú pozitív vagy negatív genommal rendelkező RNS vírusok, ami azt mutatja, hogy eltérő genomfelépítést mutató vírusokkal szemben is jó eséllyel hatékony lehet . A 21 vírus közül 12 szőlőből került eltávolításra, a szőlőből sikeresen eliminált szőlővírusok rendszertani (ICTV) besorolását mutatja az 1. ábra . A szőlőből eddig kizárólag pozitív egyszálú RNS genomot tartalmazó vírusok kerültek embriogenezissel eliminálásra .

A nehezen eliminálható kórokozók közül a szomatikus embriogenezis nemcsak a vírusoktól, hanem a viroidoktól való mentesítésre is alkalmas . Eddig hat különböző viroid mentesítésére használták fel sikeresen, ezek közül három a szőlőt is fertőzi . Arról, hogy a szomatikus embriogenezis milyen hatékonyságú a fitoplazmák eltávolítására, kevés adat áll rendelkezésre . Cukornád esetében használták fitoplazmamentesítésre, ott a regenerált növények 100%-a mentesnek bizonyult (Parmessur és mtsai, 2002) .

A szomatikus embriogenezis hatékonysága a különböző szőlő vírusok és viroidok esetében A szomatikus embriogenezis történhet közvetlenül az anyanövény valamelyik sejtjéből vagy pedig az anyanövény sejtjeiből képződött kalluszból (direkt és indirekt szomatikus embriogenezis) . Az eddigi tapasztalatok azt mutatják, hogy a direkt embriogenezis esetében kicsi a vírusok átjutásának esélye, míg a kallusz fázisban bizonyos vírusok (pl . nepovírusok) viszonylag sokáig fennmaradhatnak . Ugyanakkor a kallusz fázis fenntartása során egyre több olyan sejt képződik, amelyik vírusmentes, és jellemzően azokból a sejtekből kapunk növényeket, amelyek nem vírushordozók . Így mentesítési szempontból az embriogenezis direkt vagy indirekt jellege nem akadályozó tényező .

A szőlőből szomatikus embriogenezissel eliminált szőlő vírusok és viroidok többségükben súlyos betegségeket okozhatnak a szőlőn, de olyan újabban leírt vírusok is találhatóak köztük, amelyek gazdasági jelentősége még nem ismert (1. táblázat) .

A legnehezebben eliminálható vírus egyértelműen a GFLV . Mivel a GFLV nem a floemhez kötött vírus, hanem képes a kalluszsejtekkel is terjedni, így érthető, hogy a mentesítési hatékonysága a nemzetközi irodalom szerint meglehetősen szóródik (0-100%), a saját kísérleteinkben a mentesítés hatékonysága ugyanakkor 100% volt . Érdekes módon a szintén nepovírusok közé tartozó ArMV esetében csak egy esetben publikálták az embriogenezis hatékonyságát, ami ott 100%-nak bizonyult (Borroto-Fernandez és mtsai, 2009) .

A GFLV mellett saját eredményeink szerint a másik nehezebben kizárható ágens a GYSVd-1 viroid . A nemzetközi szakirodalom szerint ennek mentesítési hatékonysága 100%, ugyanakkor saját, szekvenáláson alapuló eredményeink szerint ez 8% és 86% között mozgott . A másik elterjedt viroid, a HSVd esetében már kiegyensúlyozottabb a helyzet, saját méréseink 81% és 100% közötti hatékonyságot mutattak .

Számos vírus, köztük általában a floémhoz kötött vírusok egyértelműen nagy hatékonysággal eliminálhatóak, ide tartoznak a GLRaV-1,2,3, GVA, GFkV, illetve a kevésbé ismert, vagy újabban felfedezett GPGV, GRVFV, GSyV-1 és GVT .

Érdekes kivételt képez a GRSPaV . Míg a nemzetközi eredmények a mentesítés hatékonyságát 100%ban adják meg (Gribaudo és mtsai, 2006), addig a saját eredményeink 54% és 100% közötti hatékonyságot mutatnak, ami a GFLV-hez hasonló szintet mutat . Ugyanakkor a GRSPaV-vel közeli rokon GVT esetében 100%-os hatékonyságot értünk el . Az egyes vírusoknál és viroidoknál eddig a nemzetközi szakirodalomban publikált mentesítési hatékonyságokat a 2. ábra mutatja . Szomatikus embriogenezis indukálása A szomatikus embriogenezis a különböző genotípusokon eltérő hatékonysággal váltható ki . A leggyakrabban alkalmazott növényi részek a portok és termő, ami a technológiai szempontból behatárolja az indítási időszakot . A leggyakrabban használt hormonhatású kombinációk a 2,4-D+BAP, 2,4-D+BAP+NOA, illetve a TDZ önállóan vagy kombinálva . Bár a felhasználható hormonkoncentrációk beállítása nehézséget jelent, a szőlő esetében több mint száz genotípuson bizonyult sikeresnek eddig az embriogén kallusz indukciója (Oláh és mtsai, 2009) .

Összehasonlítás más módszerekkel

A szomatikus embriogenezis mellett potenciálisan elterjedt módszerek a merisztéma izolálás és a kemoterápia . A hatékony merisztéma izolálás és kemoterápia szintén hormon összetételében különböző, fajtára optimalizált táptalajokon történik. A merisztéma izolálás során 1 óra alatt kb . 10-15 db merisztémát lehet átlagosan preparálni, míg 2 mm-es hajtáscsúcsból 20-30 darabot tudunk indítani a kemoterápiát követően, illetve 150-200 db portokot helyezhetünk táptalajra embriogenezis indukálásához, ha figyelembe vesszük az előkészítéshez szükséges időt is .

A különböző módszerek hatékonysága fajtánként rendkívül eltér, hiszen pl . az adott fajta szaporíthatósága in vitro körülmények között, az embriogenezis vagy növényregeneráció sikeressége vagy sikertelensége genotípus függő is . Ezért a mentesítési módszerek hatékonysága csak egy adott fajta esetén összevethető, ott viszont nagyon nagy eltérést mutathat . Egy vírusmentes növény előállításához általában 50-80 merisztéma, 20-25 kemoterápián átesett hajtáscsúcs vagy 200 portok szükséges, hozzátéve, hogy ezek csak irányszámok .

Genetikai stabilitás

A publikációk döntő többsége arról számol be, hogy a vírusmentesítés során a szomatikus embriogenezissel előállított növények nem mutattak fenotípusos eltéréseket a kiindulási növényállományhoz képest, illetve nem tapasztaltak kromoszómaszám változást . A kávé esetében a szomatikus embriogenezisből származó növények közül az ültetvényekben kb . minden századik mutatott valamilyen fenotípusos eltérést (Etienne és mtsai, 2016), míg szőlő esetében egy SSR analízis során azt találták, hogy a vizsgált lókuszok alapján a növények csupán 10%-a egyezett meg az anyanövényekkel (San Pedro és mtsai, 2017) . Ez azt jelenti, hogy míg látható fenotípusos változások viszonylag ritkán következnek be a szomatikus embriogenezis alkalmazása során, de a fenotípusosan nem megjelenő tulajdonságokban gyakoribbak lehetnek a genetikai eltérések . Természetesen az embriogenezis körülményeinek megválasztásánál is törekednünk kell arra, hogy minimalizáljuk a mutációs rátát . A variabilitás gyakorisága csökkenthető alacsonyabb hormonszintek használatával és az embriogén kallusz állapot fenntartásának minimalizálásával . Gyakorlati szempontból tehát a szomaklonális variabilitás lehetősége nem jelent aránytalan kockázatot a klónszelekcióra vagy az új fajták előállítására nézve .

Összefoglalás

Összességében a szomatikus embriogenezis egy kiváló alternatív módszer a szőlő klónok komplex patogénmentesítésre, és használata kifejezetten indokolt, amikor a merisztéma tenyésztés nem jár sikerrel . A termesztés nem mondhat le egy olyan módszerről, ami a gazdasági károkat okozó vírusokat nagy hatékonysággal egyetlen laboratóriumi eljárással képes eliminálni komplex fertőzések esetében is . A szomatikus embriogenezis egyértelműen képes az új klónok és fajták esetében a termesztés számára életbevágóan fontos egészséges prebázis állományok biológia alapjainak létrehozására .

Köszönetnyilvánítás Munkánkhoz az NKFIH nyújtott anyagi támogatást (K131685) . Köszönjük Németh Krisztina tudományos főmunkatársnak (MATE SZBI) a kézirat elkészítéséhez adott segítő javaslatait .

Az irodalomjegyzék a szerzőknél érhető el.

Forrás: Agrofórum